Laporan Praktikum SDS-PAGE

 SDS-PAGE atau Elektroforesis gel poliakrilamida-Sodium Dodesil Sulfat adalah teknik elektroforesis gel yang menggunakan poliakrilamida untuk memisahkan protein yang bermuatan berdasarkan berat molekulnya. Sodium Dodesil Sulfat (SDS) merupakan deterjen ionik yang dapat melarutkan molekul hidrofobik yang memberikan muatan negatif pada keseluruhan struktur protein. Cara kerja SDS-PAGE adalah dengan menghambat interaksi hidrofobik dan merusak ikatan hidrogen (Rath et al, 2009). Metode SDS-PAGE digunakan untuk memisahkan protein demi keperluan biokimia, genetika forensik, dan biologi molekuler (Shapiro, 1997). 

Gambar 1. SDS poliakrilamid gel elektroforesis (SDS-PAGE)

 

Metode ini diawali dengan preparasi sampel untuk membuat sampel bermuatan sama sehingga muatan tidak memengaruhi pergerakan komponen sampel dalam gel. Preparasi dilakukan dengan cara mendenaturasi protein menggunakan SDS dan memutus ikatan disulfida pada struktur protein menggunakan beta-merkaptoetanol, bila perlu denaturasi didukung dengan memanaskan sampel. Selanjutnya gel poliakrilamida dibuat menggunakan cetakan gel membentuk lembaran segiempat dengan ketebalan tertentu. Setelah sampel dimasukkan dalam sumur gel, gel dialiri arus listrik sehingga komponen yang terdapat dalam sampel akan terpisah melewati matriks gel berdasarkan berat molekulnya (Rath et al, 2009).

Untuk melihat pita komponen yang terbentuk, gel perlu diwarnai dengan pewarna khusus. Beberapa pewarna yang dapat digunakan dalam SDS-PAGE adalah Commasie Brilliat Blue dan Silver Salt Staining. Commasie Brilliant Blue mengikat protein secara spesifik dengan ikatan kovalen. Silver Salt Staining memiliki sifat lebih sensitif dan akurat namun membutuhkan proses yang lebih lama (Shapiro, 1997). 

Sampel dapat berupa bahan yang mengandung protein atau asam nukleat. Ini mungkin berasal dari  biologis, misalnya dari sel prokariotik atau eukariotik, jaringan, virus, sampel lingkungan, atau protein dimurnikan. Dalam kasus jaringan padat atau sel, dipecah secara mekanis menggunakan blender (untuk volume sampel yang lebih besar), menggunakan homogenizer (volume yang lebih kecil), dengan sonikator atau dengan menggunakan tekanan tinggi  dan kombinasi biokimia dan teknik mekanik termasuk berbagai jenis filtrasi dan sentrifugasi  dapat digunakan untuk memisahkan kompartemen sel yang berbeda dan organel sebelum elektroforesis. Biomolekul sintetis seperti oligonukleotida juga dapat digunakan sebagai analit

Sampel untuk menganalisis secara opsional dicampur dengan denaturant kimia jika diinginkan, biasanya SDS untuk protein atau urea untuk asam nukleat. SDS merupakan detergen anionik yang denatures struktur tersier sekunder dan non-disulfida-linked, dan tambahan berlaku muatan negatif untuk setiap protein dalam proporsi massa (Minde, 2012).

Protein dapat dipisahkan berdasarkan ukuran massanya dengan elektroforesis gel poliakrilamid dengan system gerak. Sebelumnya, campuran protein dipanasi dengan natrium dedosil suldat (SDS), suatu detergen anionik utnuk menyelubungi molekul protein. Penyelubungan ini menyebabkan interaksi nonkovalen terganggu sehingga molekul protein dalam struktur primer. Anion SDS berikatan dengan rantai utama dengan rasio satu molekul SDS untuk dua residu asam amino (David, 2007).

Akrilamit merupakan suatu monomer, yang jika ada radikal bebas, biasanya diberikan oleh amonium persulfat dan distabilkan oleh TEMED, terjadi reaksi beranti sehingga monomer terpolimerisasi menjadi rantai panjang. Jika dalam rangkaian itu ada bisakrilamid, reaksi menjadi bersambung melintang menjadi gel yang pori-porinya ditentukan oleh panjang rantai dan panjang sambungan silang. Panjang rantai ini ditentukan oleh konsentrasi poliakrilamid dalam reaksi dan satu molekul sambungan saling terjadi pada setiap 29 monomer akrilamid (Sudjadi, 2008).

Gel poliakrilamid dibuat dengan cara menuangkan antara dua lempeng kaca yang dipisahkan dengan pembatas dengan ketebalan tertentu. Gel poliakrilamid dapat berukuran 5-50 cm, panjangnya bergantung pada keperluan dan dilakukan elektroforesis dengan cara vertikal. Sistem ini menunjukkan keunggulan daripada gel agarosa yaitu kekuatan pemisahannya sangat besar sehingga dapat memisahkan satu pasang basa (Sudjadi, 2008)

Merkaptoetanol atau ditiotreitol ditambahkan untuk mereduksi ikatan disulfida. Kompleks SDS dengan protein terdenaturasi mempunyai jumlah muatan negatif yang sebanding dengan ukuran protein. Muatan negatif yang terdapat pada ikatan SDS lebih besar daripada muatan pada protein asli . kompleks protein-SDS kemudian dielektroforesis, sehingga semua molekul protein bergerak menuju kutub positif. Ketika elektroforesis selesai, protein dalam gel dapat ditampakkan oleh pewarnaan dengan perak atau zat warna seperti Coomasie blue, yang akan menampakkan beberapa pita. Coomasie blue berikatan dengan protein berdasarkan interaksi ionik antara gugus sulfit pada Coomasie blue dengan asam amino basa, dan interaksi hidrofobik cincin Coomasie blue. Pewarna mampu menghasilkan pita pada jumlah protein 10-100 ng (Sudjadi, 2008).

Protein kecil akan bergerak cepat melewati gel, sedangkan protein besar bergerak lebih lambat. Mobilitas kebanyakan polipeptida dibawah kondisi seperti ini berbanding lurus terhadap log ukurannya. Beberapa protein yang banyak mengandung karbohidrat dan protein membran tidak mengikutii aturan ini. Akan tetapi metode SDS-PAGE (elektroforesis gel poliakrilamid-SDS) ini sangat cepat, peka dan dapat menghasilkan pemisahan yang baik (Sudjadi, 2008).

1.Bahan dan alat

Bahan-bahan yang digunakan dalam acara praktikum antara lain Larutan stok SDS-PAGE (30% Acrylamid, Resolving buffer dan Stacking buffer), 5x SDS  sampel buffer (62,5 mm Tris-HCl, pH 6,8; 10% gliserol; 5% β-merkaptoetanol; 2,5 SDS dan Brom Phenol Blue/BPB), molekul standar (BSA/Bovine Serum Albumin), sampel protein, TEMED (tetrametil etilendiamin), APS, running buffer 10%/buffer Tris-Glisin-SDS (3 g Tris,; 14,4 g Glisin; 10% SDS), staining (0,25 g(0,1%) Commasie blue; 25 ml (10%) asam asetat; 125 ml (50%) methanol, destaining (75 ml (5%) methanol; 40 ml (10%) asam asetat; 50 ml isopropanol; 335 ml dH₂O) 

Peralatan yang digunakan antara lain plat gelas, tangki elektroforesis, power supply dan sisir.

 

2. Cara Kerja

a. Pembuatan stok SDS-PAGE gel

·         30% Acrylamide (untuk volume 100 ml)

29,25 gr Acrylamide, 0,75 gr Bis-Acrylamide, 100 ml D-H₂O.

·         IB solution (pH 8,8) (V: 500 ml) Resolving Buffer

90,83 gr Tris-HCl, 2,0 gr SDS, 500 ml D-H₂O (fill up)

·         IIB solution (pH 6,8) (V: 500 ml) Stacking Buffer

30,28 gr Tris-HCl, 2,0 gr SDS, 500 ml D-H₂O (fill up)

·         25% Ammonium Peroxodisulfate (APS) (V: 1 ml)

250 mg APS, 1 ml D-H₂O

 

 

 

 

b. Pembuatan resolving gel dengan berbagai konsentrasi

Konsentrasi Resolving (%)	21	20	18	15	12	10	8	6
30% Acrylamide (ml)	14	13	12	10	8	7	5,3	4
D-H2O (ml)	2	3	4	6	8	9	10,7	12
IB solution (ml)	4	4	4	4	4	4	4	4
TEMED (µl)	10	10	10	10	10	10	10	10
25% APS (µl)	50	50	50	50	50	50	50	50

 

c. Pembuatan stacking gel

Konsentrasi Stacking (%)	4
30% Acrylamide (ml)	1,3
D-H2O (ml)	6,7
IIB solution (ml)	2
TEMED (µl)	20
25% APS (µl)	50

 

d. Pembuatan gel poliakrilamid

Resolving dan stacking gel dimasukkan kedalam erlemeyer yang berbeda, diamkan sambil mengeset alat (disiapkan cetakan kaca dan sisir). Kaca diberi tanda ± 3 cm sebagai batas larutan resolving gel. Sebelum dimasukkan dalam cetakan, ditambahkan 25% APS dan digoyang secara perlahan. Resolving dimasukkan ke dalam cetakan, ditambahkan isopropanol atau akuades, didiamkan ± 20-40 menit hingga gel mengalami polimerisasi. Isopropanol/akuades dibuang dari cetakan atau dihisap dengan kertas hisap. Larutan stacking gel dituang pada cetakan dan sisir dipasang dan didiamkan ± 20 menit. Setelah terjadi polimerisasi sisir diambil dengan hati-hati agar sumuran tidak rusak. Gel poliakrilamid dipadang pada tangki elektroforesis, running buffer dituang, sampel protein yang sudah didenaturasi dan marker dimasukkan ke dalam sumuran. Proses running dilakukan kurang lebih 2 jam pada tegangan 100 volt sampai larutan sampel dalam sumuran yang berwarna biru berada di bawah. Setelah selesai, gel diambil dari cetakan dan diwarnai dengan menggunakan Commasie blue selama semalam, kemudian dimasukkan kedalam larutan destaining dan pita protein yang terbentuk diamati.

 

D. Hasil dan Pembahasan

1. Hasil

Tabel 1. Jarak migrasi protein marker SDS-PAGE Eschericia coli beserta nilai rf dan berat molekul dari masing‐masing  pita

Jarak marker (cm)	rf marker	BM marker (kD)	log BM marker
2	0,182	250	2,398
2,5	0,227	150	2,176
3	0,273	100	2,000
3,5	0,318	75	1,875
4,3	0,391	50	1,699
5,1	0,464	37	1,568
6,4	0,582	20	1,301
7,1	0,645	15	1,176
7,8	0,709	10	1,000

Keterangan : Jarak loading dye = 11 cm

Gambar 2. Kurva log berat molekul protein marker SDS-PAGE Eschericia coli

 

Tabel 2. Jarak migrasi protein Eschericia coli dan BSA beserta nilai rf dan berat molekul dari masing-masing pita.

Jarak sampel (cm)	rf sampel	log BM sampel	BM sampel (kD)
E. Coli        2,5	0,227	2,165	146,16
3	0,273	2,053	113,03
3,3	0,300	1,986	96,87
3,8	0,345	1,875	74,91
4,6	0,418	1,696	49,65
4,9	0,445	1,629	42,56
5,1	0,464	1,584	38,40
5,6	0,509	1,473	29,69
6,7	0,609	1,227	16,87
7,1	0,645	1,138	13,73
7,8	0,709	0,981	9,58
BSA            4	0,364	1,829	67,45

Keterangan : Jarak loading dye (pewarna) = 11 cm

y = -2,456x + 2,723

 

Tabel 3. Jarak migrasi protein marker SDS-PAGE papain  beserta nilai rf dan berat molekul dari masing‐masing  pita

BM marker(kD)	Jarak marker (cm)	log BM marker	rf marker
250	1,5	2,398	0,15
150	2	2,176	0,2
100	2,4	2,000	0,24
75	2,8	1,875	0,28
50	3,9	1,699	0,39
37	4,3	1,568	0,43
20	6	1,301	0,6
15	7,1	1,176	0,71
10	9,2	1,000	0,92

Keterangan : Jarak loading dye = 10 cm

 

 

Tabel 4. Jarak migrasi protein papain dan BSA beserta nilai rf dan berat molekul dari masing-masing pita.

Jarak sampel (cm)	rf sampel	log BM sampel	BM sampel (kD)
Papain             6,3	0,630	1,34698	22,20
6,9	0,690	1,24174	17,44
BSA                3,5	0,350	1,83810	68,86

Keterangan : Jarak loading dye (pewarna) = 10 cm

y = -1,754x + 2,452

 

3. Pembahasan

Elektroforesis SDS-PAGE terdiri atas tangki elektroforesis yang terdiri atas power supply yang berfungsi sebagai sumber arus listrik, buffer sebagai penghantar aliran listrik sehingga proses running protein dapat berlangsung, gel poliakrilamid berfungsi untuk media embedding atau sectioning sampel, dan anoda dan katoda yang berfungsi sebagai arah gerak arus listrik yaitu dari katoda kearah anoda.

 

Prinsip kerja SDS-PAGE atau Elektroforesis gel poliakrilamida-Sodium Dodesil Sulfat adalah memisahkan protein yang bermuatan berdasarkan berat molekulnya. Sodium Dodesil Sulfat (SDS) merupakan deterjen ionik yang dapat melarutkan molekul hidrofobik yang memberikan muatan negatif pada keseluruhan struktur protein. Cara kerja SDS-PAGE adalah dengan menghambat interaksi hidrofobik dan merusak ikatan hidrogen (Rath et al, 2009).

Polyacrylamide gel (PAG) telah dikenal sebagai media embedding potensial untuk sectioning jaringan.  Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) (Hanya digunakan dalam gel denaturasi protein) SDS adalah agen deterjen yang kuat yang digunakan untuk denaturasi protein, polipeptida individu. Amonium persulfat (APS) merupakan sumber radikal bebas dan sering digunakan sebagai inisiator untuk pembentukan gel (Missouri University, 2002). Merkaptoetanol atau ditiotreitol ditambahkan untuk mereduksi ikatan disulfida (David, 2009). TEMED menstabilkan radikal bebas dan meningkatkan polimerisasi. Tingkat polimerisasi dan sifat-sifat gel yang dihasilkan tergantung pada konsentrasi radikal bebas. Peningkatan jumlah radikal bebas menyebabkan penurunan rata-rata panjang rantai polimer, peningkatan kekeruhan gel dan penurunan elastisitas gel. Coomassie Brilliant Blue (CBB) adalah pewarna anionik, yang non-spesifik mengikat protein. Struktur CBB didominasi non-polar (Sudjadi, 2008).

Pada proses  elektroforesis SDS-PAGE menggunakan larutan buffer yang berfungsi untuk mempertahankan nilai pH, jika ada penambahan sejumlah kecil asam atau basa. Larutan buffer terdiri dari asam lemah (proton donor) dengan basa konjugatnya (proton aseptor) (Mohan, 2006). Staining berfungsi untuk membantu memonitor jalannya elektroforesis (Wilson dan Walker, 2000). Destaining digunakan untuk membersihkan gel dari pewarna sehingga pita dapat terlihat (Boyer, 2003).

Pada proses migrasi protein dpada saat elektroforesis dipengaruhi oleh eberapa faktor yaitu (1) Ukuran molekul protein, Migrasi molekul protein berukuran besar lebih lambat daripada migrasi molekul berukuran kecil. (2)  Konsentrasi gel, Migrasi molekul protein pada gel berkosentrasi rendah lebih cepat daripada migrasi molekul protein yang sama pada gel berkosentrasi tinggi. (3) Bufer (penyangga) dapat berperan sebagai penstabil medium pendukung dan dapat mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena ion sebagai pembawa protein yang bermuatan. (4)  Medium penyangga, Medium pendukung ideal untuk elektroforesis adalah bahan kimia inert yang bersifat relatif stabil, mudah ditangani dan mempunyai daya serap yang baik, sebagai migrasi elektron atau penyaringan berdasarkan ukuran molekul seperti gel poliakrilamid. (5)  Kekuatan voltase, kecepatan migrasi molekul sebanding dengan tingginya voltase yang digunakan. (6) Temperatur medium disaat proses elektroforesis berlangsung. Jika temperature tinggi akan mempercepat proses bermigrasinya protein dan sebaliknya jika temperatur rendah akan mengurangi kekuatan bermigrasinya protein (Jena and Mackill, 2008).

Hasil dari elektroforesis SDS-PAGE dapat diketahui rata-rata berat sampel papain adalah 23787 D atau 23,8 kD dan marker yang digunakan mempunyai berat molekul rata-rata 78,5 KD, sedangkan pada sampel E.coli. mempunyai berat rata-rata 68,6 KD.

 

D. KESIMPULAN

1.        Elektroforesis gel poliakrilamida-Sodium Dodesil Sulfat adalah teknik elektroforesis gel yang menggunakan poliakrilamida untuk memisahkan protein yang bermuatan berdasarkan berat molekulnya.

2.        SDS adalah agen deterjen yang kuat yang digunakan untuk denaturasi protein, polipeptida individu

3.        Ukuran gel berdasarkan berat molekul yang akan diuji.

 

 

 

 

 

 

 

 

Daftar Pustaka

Boyer, R. 2003. Modern experimental biochemistry. The Benjamin, Cummings publishing company, Inc., California: 480 hlm.

David G. Watson. 2009. Analisis Farmasi. Jakarta : EGC.

Jena.K.K and Mackill.D.J. 2008. Molecular Markers and Their Use in Marker-Assisted Selection in Rice. Crop Science Journal. 46: 1266 – 1276.

Minde DP (2012). "Determining biophysical protein stability in lysates by a fast proteolysis assay, FASTpp". PLOS ONE 7 (10): e46147.

Rath, Arianna and Glibowicka, Mira and Nadeau, Vincent G. and Chen, Gong and Deber, Charles M. (2009). "Detergent binding explains anomalous SDS-PAGE migration of membrane proteins". Proceedings of the National Academy of Sciences 106 (6): 1760–1765.

Shapiro AL, Viñuela E, Maizel JV Jr. 1997. "Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels.". Biochem Biophys Res Commun. 28 (5): 815–820.

Sudjadi. 2008. Bioteknologi Kesehatan. Kanisius. Yogyakarta. Pp: 101-104.

Wilson K. 2000. Protein and enzyme techniques In Practical Biochemistry, (ed. Wilson K. And Walker JM), Cambridge University Press. p.161‐226.